荧光素标记抗体注意事项

　　荧光素标记抗体技术原理：

　　目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

　　荧光素标记抗体注意事项：

　　（1）影响标记的因素主要有温度、时间、pH及荧光素与抗体蛋白的量等。标记所需的时间与温度呈反比，4℃需12-18h，20-25℃需2-4h；PH低，标记慢，但如pH大于10，抗体易变性，故pH以9.0-9.5为宜；抗体蛋白量低标记慢，以20mg/ml为宜；荧光素如使用FITC无定型粉末时，用量可稍大，如为结晶型，用量则应减少。

　　（2）标记抗体中如存在2×10-5mg/ml游离荧光素时即可产生非特异性荧光，故用Sephadex凝胶柱过滤时，上样量不宜太多，一般上样量小于柱床容积的1/2。

　　（3）免疫血清中的白蛋白易与荧光素结合，在每ml抗体溶液中白蛋白量为6.25×10-2mg/ml时，即可出现非特异性荧光。故待标记的抗体以用纯化的抗体为好。

　　（4）半透膜法（Clark 法）适用于小量抗体的标记。标记效果比直接法均匀，非特异性染色较少，结合物中游离荧光素含量较低，易于彻底去除，但该法荧光素用量较大。

　　（5）用过的Sephadex凝胶柱常附有荧光素而难于除尽，可使用0.1mol/L HCl处理0.5h，再依次用蒸馏水、PBS流洗，平衡。

　　用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化提取IgG后再作标记。作为荧光素标记抗体应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。⑤标记方法简单、安全无毒。⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

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